Диагностикум клещевого энцефалита

4,100.00

Описание

Диагностикум клещевого энцефалита для РТГА, РСК, РРГ (Набор реагентов)

1.   НАЗНАЧЕНИЕ

Набор реагентов предназначен для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита (КЭ) в образцах сывороток или плазм крови людей и животных в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции радиального гемолиза в геле (РРГ).

Область применения:

1.     Клиническая микробиология. Для подтверждения клинического диагноза у больных с подозрением на клещевой энцефалит исследуют парные сыворотки, полученные на 5-7 и 14-21 дни заболевания.

2.     Эпидемиологические исследования. Набор может быть использован для изучения иммунного статуса людей и животных в эндемичных районах. Для этих целей рекомендуется комплексная диагностика в РТГА и РРГ.

3.     Производство иммунобиологических препаратов. Набор используют для оценки специфической активности препаратов иммуноглобулинов против КЭ, для изучения клинической эффективности вакцины клещевого энцефалита в РТГА. Набор и отдельные реагенты могут быть использованы для производства и контроля других диагностических препа­ратов клещевого энцефалита (иммуноферментных тест-систем).

2.  ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1.  Принцип метода.

Специфическим компонентом набора является диагностикум КЭ, который способен выявлять антитела к вирусу клещевого энцефалита в сыворотках крови (плазме, асцитной жидкости) людей и животных в РТГА, в РСК, в РРГ.

Принцип РТГА: диагностикум КЭ (антиген вируса клещевого энцефалита) способен вызывать агглютинацию взвеси гусиных эритроцитов в зоне слабокислых значений pH. В присутствии сыворотки, содержащей антитела к вирусу клещевого энцефалита, агглю­тинация тормозится (подавляется), благодаря блокировке ответственного за этот феномен антигена — гемагглютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона.

Принцип РСК: комплекс антиген-антитело обладает способностью связывать комплемент. В реакции участвуют две системы антиген+антитело: специфическая — (диагностикум КЭ + сыворотка крови людей или животных) и индикаторная — (эритроциты барана + гемолизин). При взаимодействии вирусных антигенов с антителами (на первом этапе реакции) с комплексом антиген-антитело связывается комплемент, и он уже не может быть использован для лизиса эритроцитов (которые в смеси с гемолизином добавляют на втором этапе реакции). Таким образом, отсутствие лизиса эритроцитов говорит о положительном результате реакции (наличии антител к вирусу клещевого энцефалита в исследуемом образце).

Принцип РРГ: при взаимодействии с антителами сенсибилизированных вирусным антигеном эритроцитов барана в присутствии комплемента происходит реакция лизиса эритроцитов. Суспензию бараньих эритроцитов обрабатывают диагностикумом КЭ, отмывают и вносят в расплавленный агарозный гель, одновременно добавляя туда комплемент. После перемешивания гель тонким слоем наливают на стеклянную пластину и после затвердения вырезают в нем лунки диаметром 2 мм. В лунки наливают по 5 мкл исследуемой сыворотки (предварительно прогретой для удаления содержащегося в них комплемента). Диффундируя через гель, антитела образуют комплекс с антигеном и комплементом на поверхности эритроцитов, следствием чего является лизис. Вокруг лунок образуется прозрачная зона гемолиза, диаметр которой прямо пропорционален концен­трации специфических антител.

2.2.  Состав набора.

1.   Диагностикум клещевого энцефалита (диагностикум КЭ) — антиген вируса клеще­вого энцефалита, полученный из мозга белых мышей, инфицированных вирусом КЭ, ме­тодом боратно-солевой экстракции, очищенный протаминсульфатом или фреоном-113, инактивированный бетапропиолактоном, лиофилизованный — аморфный порошок кремо­вого цвета, после растворения — прозрачная жидкость светло-желтого цвета, выпускаемый в комплекте с реагентами для постановки РТГА, РСК и РРГ. Титр специфических гемагглютининов не ниже чем 1:160, комплементсвязывающих антигенов — на ниже чем 1:32 — 10 ампул по 1 мл.

2.   Положительный контрольный образец для РТГА (К+ РТГА) — асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ (в виде 10 % вируссодержащей суспензии мозга крысят-сосунков) с последующим введением в брюшную полость крыс клеток опу­холи яичника крысы для индукции асцита, обработанная хлороформом, каолином и гуси­ными эритроцитами, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрачная жидкость от светло-желтого до светло-рубинового цвета. Титр антигемагглютинирующих антител — не ниже чем 1:160 — 2 ампулы по 1 мл.

3.   Отрицательный контрольный образец для РТГА (К РТГА) — асцитная жидкость неиммунизированных крыс, индуцированная путем введения клеток опухоли яичника крысы, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрач­ная жидкость от светло-желтого до светло-рубинового цвета — 2 ампулы по 1 мл.

4.    Положительный контрольный образец для РСК (К+ РСК) — асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ, обработанная хлороформом, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрач­ная жидкость от желтого до рубинового цвета. Титр комплементсвязывающих антител не ниже чем 1:32-2 ампулы по 0,5 мл.

5.    Отрицательный контрольный образец для РСК (К РСК) — асцитная жидкость неиммунизированных крыс, обработанная хлороформом, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрачная жидкость от желтого до рубинового цвета — 2 ампулы по 0,5 мл.

6.        Смесь солей для приготовления боратного буферного раствора (ББР) pH 9,00±0,05 — таблетка белого цвета массой 1,05+0,02 г, в состав которой входят: натрия хлорид — 0,7 г; кислота борная — 0,32 г; кальция стеарат или магния стеарат (наполнитель)

—    0,03 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора ББР. По 1 таблетке в пакете из ПЭ пленки — 3 пакета.

7.        Смесь солей для приготовления фосфатного буферного раствора (ФБР) pH 6,20+0,05 — таблетки белого цвета общей массой 4,12+0,08 г, в состав которых входят: натрия хлорид — 0,88 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный — 1,06 г; на­трий фосфорнокислый однозамещенный двуводный — 2,06 г; кальция стеарат или магния стеарат — 0,12 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора ФБР. По 4 таблетки в пакете из ПЭ пленки — 2 пакета.

8.    Смесь солей для приготовления раствора Альсевера или Гепарин, раствор для внутривенного и подкожного введения 5000 МЕ/мл (ФСП 42-0504-7813-06) — 1 ампула (1 мл).

Смесь солей для приготовления раствора Альсевера — таблетки белого цвета общей массой 5,30+0,10 г, в состав которых входят: кислота лимонная моногидрат — 0,8 г; на­трий лимоннокислый трехзамещенный моногидрат — 2,26 г; глюкоза — 2,2 г; кальция стеа­рат или магния стеарат — 0,04 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора. По 5 (6) таблеток в пакете из ПЭ пленки — 1 пакет.

9.    Каолин (белая глина) по ГФ X, ст. 109 — 2 стакана по 30 г или 1 стакан по 60 г.

В коробку с набором вкладывают инструкцию по применению и нож или ска­рификатор ампульный. При упаковке ампул, имеющих кольцо излома или точку для вскрытия, нож ампульный или скарификатор ампульный не вкладывают.

Набор реагентов рассчитан на исследование 200 сывороток одновременно в трех тестах: РТГА, РСК, РРГ. Смеси солей для приготовления растворов и каолин, предназна­ченные для постановки РТГА, приложены в количестве, рассчитанном для исследования 200 или 350 сывороток при их предварительной обработке в объеме 100 мкл или 50 мкл соответственно.

3.   АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

РТГА является высокочувствительным анализом. Для флавивирусов (к которым от­носится вирус КЭ) РТГА дает группоспецифический ответ (т.е. может выявлять антитела как к видоспецифичным, так и группоспецифичным антигенным детерминантам флавиви­русов). В частности, могут наблюдаться перекрестные реакции с сыворотками, содержа­щими антитела против вирусов комплекса КЭ и комплекса японского энцефалита, но на уровне значительно ниже, чем с гомологичным антигеном.

РСК относится к числу малочувствительных методов (выявляет антитела, когда их много), при этом наряду с видоспецифичными могут обнаруживаться (в меньшей степе­ни) и группоспецифичные антитела флавивирусов. При анализе в РСК могут наблюдаться также перекрестные реакции с сыворотками, содержащими антитела к антигенам мозго­вой ткани мышей. Обнаружение специфических комплементсвязывающих антител свиде­тельствует о недавно перенесенной инфекции.

РРГ обладает чувствительностью на уровне не ниже, чем в РТГА. В данной реакции IgG-антитела выявляются даже спустя годы после заболевания.

При анализе исследуемых образцов положительным результатом в РТГА следует считать титр не ниже 1:20, в РСК — не ниже 1:4, в РРГ — зону гемолиза не менее 4 мм.

4.  МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Набор безопасен (не содержит материалов, которые могут инфицировать персонал во время анализа). Однако исследуемые сыворотки крови могут содержать различные инфек­ционные агенты. При работе с ними следует соблюдать СП 1.3.1285-03 «Безопасность рабо­ты с микроорганизмами I-II групп патогенности»:

—   работать в резиновых перчатках;

—   использовать автоматические пипетки (дозаторы) с одноразовыми пластиковыми наконечниками;

—        все использованные материалы, сточные растворы, одноразовую лабораторную посуду перед утилизацией подвергать обработке дезинфицирующим раствором (6 % рас­твор перекиси водорода или 3 % раствор хлорамина в течение 4 ч) или автоклавированием при давлении пара 0,2 МПа и температуре 132 °С в течение 45 мин;

—   оборудование, находившееся в контакте с исследуемыми образцами, следует де­зинфицировать 70 % этиловым спиртом.

При работе необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при ра­боте в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения (Москва, 1981 г.).

5.  ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

—   рН-метр;

—   весы торсионные (для постановки РРГ);

—   часы;

—   дозаторы (пипетки) переменного объема (механические или электронные): 8- или 12-канальные с объемом дозирования от 5 до 50 мкл и 1- канальные с объемом до­зирования от 10 (20) до 100 (200) мкл, от 100 до 1000 мкл и от 1 до 5 (10) мкл (для поста­новки РРГ);

—   наконечники для дозаторов на 300 (350) мкл, 1000 мкл и 10 мкл (для постановки РРГ);

—   пипетки стеклянные градуированные 2-го класса точности вместимостью 10; 5; 2; 1 мл (ГОСТ 1770-74);

—   холодильник бытовой;

—   аквадистиллятор;

—   водяная баня (аппарат для инактивации сывороток);

—   термостат;

—   центрифуга лабораторная;

—   штативы для пробирок;

—   планшеты для иммунологических реакций по ТУ 64-2-278-79;

—   чашки Петри диаметром 100 мм (для постановки РРГ);

—   стаканы химические мерные или колбы мерные вместимостью 100 мл, 1000 мл (ГОСТ 1770-74 или ГОСТ 25336-82);

—   пробирки стеклянные вместимостью 10 мл (ГОСТ 25336-82) или флаконы ФО-Ю или Ф0-20 (ТУ 9461-025-00480678-99 или ТУ 9461-010-00480514-99);

—   груша резиновая;

—   шприц (ТУ 64-1-378-90) вместимость по 10 или 20 мл;

—   бумага фильтровальная (ГОСТ 12026-76);

—   вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72) или очищенная (ФС 42-2619-97);

—   0,9 % раствор натрия хлорида по ГОСТ 4233-77 или ФСП 42-4119-08, или ФСП 42-1619-07 pH 7,2-7,4 стерильный.

Другие реактивы и материалы, необходимые для постановки анализов, описаны в разделе 7 в соответствующих подразделах «Подготовка реагентов для анализа».

6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Для анализа пригодны пробы сывороток или плазмы крови (с добавлением цитрата, гепарина, ЭДТА) человека и животных, полученные стандартными лабораторными мето­дами. В специальных случаях для анализа можно использовать асцитные жидкости жи­вотных, освобожденные от опухолевых клеток.

Пробы, подлежащие анализу, должны быть свежими и свободными от микробной контаминации во избежание ошибочных результатов. Пробы можно хранить при темпера­туре от 2 до 8 °С не более 2 недель или при температуре не выше минус 20 °С не более 1 года аликвотами (их повторное замораживание и размораживание не рекомендуется).

Образцы, содержащие осадок, следует очистить центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин.

Для РТГА исследуемые образцы перед анализом на антитела к вирусу КЭ обрабаты­вают каолином, чтобы удалить неспецифические ингибиторы гемагглютинации (ГА), а затем освобождают от нормальных гетероагглютининов, адсорбируя их эритроцитами гуся.

Для РСК исследуемые образцы сывороток (плазм) перед анализом прогревают для инактивации содержащегося в них комплемента. Образцы разводят Разбавителем (приго­товление см. п. 7.2.1.1) 1:4 или 1:8 и прогревают в зависимости от вида: сыворотки (плаз­мы) крови людей и лошадей — при температуре 57-59 °С, сыворотки крови морских сви­нок, крупного рогатого скота — при температуре 55-57 °С, сыворотки крови крыс, мышей, хомяков — при температуре 59-61 °С в течение 30 мин; сыворотки крови кроликов при температуре 64-66 °С в течение 20 мин.

7.    ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1. Реакция торможения гемагглютинации.

Реакцию ставят микрометодом в общем объеме 0,1 мл. Для постановки реакции используют многоканальные пипетки с объемом дозирования 5-50 мкл и погрешностью измерения объемов не более 5 % и планшеты для иммунологических реакций по ТУ 64-2-278-79.

Реакцию ставят в два этапа. Первый этап опыта — постановка реакции гемагглюти­нации (РГА) для определения титра диагностикума и его рабочего разведения; второй этап — постановка РТГА для определения титра исследуемых сывороток и контрольных образцов.

7.1.1.  Подготовка реагентов для анализа.

7.1.1.1.  Боратный буферный раствор pH 9,00± 0,05 (ББР).

Содержимое пакета со смесью солей (1 таблетка) растворяют в 100 мл воды при температуре 18-25 °С в течение 18-20 ч с последующим перемешиванием. При необходи­мости, для ускорения растворения подогревают на водяной бане при температуре 80-90 °С, перемешивают, охлаждают до температуры 18-25 °С. Нерастворимый осадок (наполни­тель) отделяют фильтрованием через бумажный фильтр после чего pH раствора доводят до 9,00±0,05 добавлением 2-2,2 мл 4 % раствора натрия гидроксида* по ГОСТ 4328-77, pH определяют потенциометрически.

Хранение: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.

* Примечание: 4 % раствор натрия гидроксида хранят при температуре 20-25 °С в пластиковом флаконе не более 14 сут, в стеклянном флаконе — не более 7 сут.

7.1.1.2.  Фосфатный буферный раствор pH 6,20±0,05 (ФБР).

Содержимое пакета со смесью солей (4 таблетки) растворяют в 100 мл воды при температуре 18-25 °С в течение 18-20 ч с последующим перемешиванием. При необходи­мости, для ускорения растворения подогревают на водяной бане при температуре 80-90 °С, перемешивают, охлаждают до температуры 18-25 °С. Нерастворимый осадок (наполнитель) отделяют фильтрованием через бумажный фильтр, pH определяют потенциометрически.

Хранение: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.

7.1.1.3.   Раствор Альсевера.

Содержимое пакета (5 или 6 таблеток) растворяют в 100 мл воды при температуре 18-25 °С в течение 18-20 ч с последующим перемешиванием. При необходимости для ус­корения растворения подогревают на водяной бане при температуре 80-90 °С, перемеши­вают, охлаждают до температуры 18-25 °С. Нерастворимый осадок (наполнитель) отде­ляют фильтрованием через бумажный фильтр.

Хранение: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.

7.1.1.4.   Раствор гепарина (применяют вместо раствора Альсевера) с активностью 2,5-3 ME в 1 мл. Для приготовления рабочего раствора гепарин с активностью 5000 ME в

1 мл смешивают с 0,9 % раствором натрия хлорида в соотношении 1:2000 или 1:1500.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 2 недель.

Остатки гепарина 5000 МЕ/мл переносят из ампулы в стерильный флакон.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение срока годности.

7.1.1.5.   Взвесь каолина 25 %.

30 г каолина соединяют со 120 мл ББР при постоянном помешивании. Используют не ранее, чем через 1 сут после приготовления, перед использованием тщательно взбалты­вают.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение любого времени.

7.1.1.6.   Взвесь эритроцитов гусей в ФБР 0,4 %.

Кровь у белых гусей берут из подкрыльцевой вены шприцем. Для предотвращения свертывания и консервации кровь смешивают с равным объемом раствора Альсевера или рабочего раствора гепарина.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение 7-8 сут.

Для получения эритроцитов непосредственно перед использованием необходимое количество крови центрифугируют при 1500-1800 об/мин в течение 8-10 мин. Осадок эритроцитов трижды отмывают, ресуспендируя в 10-15 кратном количестве 0,9 % раство­ра натрия хлорида и осаждая центрифугированием при 1500-1800 об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость сливают.

К 25 мл ФБР добавляют 0,1 мл эритроцитов из осадка. Взвесь эритроцитов хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 сут.

7.1.1.7.   Диагностикум КЭ.

Содержимое ампулы с диагностикумом КЭ растворяют в 1 мл воды, через 1-2 мин добавляют 9 мл ББР, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 1-1,5 ч для стабилизации (разведение 1:10).

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 1 сут.

7.1.1.8.   Положительный контрольный образец для РТГА (К+ РТГА).

 

В ампулу с К+ РТГА вносят 1 мл воды, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 1-1,5 ч для стабилизации.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.

7.1.1.9.   Отрицательный контрольный образец для РТГА (К РТГА).

В ампулу с К РТГА вносят 1 мл воды, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 1-1,5 ч для стабилизации.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.

7.1.1.10.     Исследуемые сыворотки.

Исследуемые сыворотки обрабатывают каолином и гусиными эритроцитами для удаления неспецифических гемагглютининов и ингибиторов гемагглютинации. К 0,1 мл сыворотки добавляют 0,4 мл ББР и 0,5 мл 25 % взвеси каолина, смесь встряхивают в тече­ние 20-25 мин при температуре 20-25 °С вручную или на аппарате для встряхивания, на­пример, АВУ-6-С, центрифугируют при 2000-2500 об/мин в течение 30-35 мин.

К надосадочной жидкости добавляют 0,025 мл неразведенных эритроцитов (из осад­ка), предварительно отмытых 0,9 % раствором натрия хлорида так, как описано в п.7.1.1.6. Пробирку со смесью помещают на лед для предотвращения гемолиза, встряхивают в те­чение 20-30 мин, затем центрифугируют при 1800-2000 об/мин в течение 15-20 мин. В ре­зультате обработки получают 0,6-0,8 мл сыворотки в разведении 1:10.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут, для длительного хранения замораживают.

7.1.2.    Проведение реакции гемагглютинации (РГА).

7.1.2.1.   Определение титра и рабочего разведения диагностикума КЭ.

В 3 ряда лунок планшета для иммунологических реакций вносят по 0,05 мл ББР. В первую лунку каждого ряда вносят по 0,05 мл диагностикума КЭ. Перемешивают 8-10 раз при помощи многоканальной пипетки и последовательно переносят во все лунки рядов по 0,05 мл, из последней лунки убирают 0,05 мл. Получают последовательные разведения диагностикума КЭ с коэффициентом 2. Ставят контроль эритроцитов на спонтанную аг­глютинацию: по 0,05 мл ББР вносят в 2-3 лунки. Во все лунки добавляют по 0,05 мл эрит­роцитов. Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости, выдерживают при темпера­туре от 18 до 25 °С в течение 30-40 мин.

Учет реакции проводят при отсутствии агглютинации в лунках контроля эритроци­тов. Результаты учитывают визуально по 4-крестовой системе:

плюс 4 (+4) — полная гемагглютинация (однородная пленка эритроцитов, покры­вающая дно лунки);

плюс 3 (+3) — гемагглютинация меньшей степени интенсивности (однородная пленка эритроцитов со следами плотного осадка эритроцитов);

плюс 2 (+2) — частичная гемагглютинация (однородная пленка эритроцитов на дне лунки в сочетании с более плотным осадком эритроцитов);

плюс 1 (+1) — следы гемагглютинации (следы однородной пленки эритроцитов на дне лунки в сочетании с плотным осадком эритроцитов);

минус (-) — отсутствие гемагглютинации (осевшие эритроциты имеют вид компакт­ного осадка).

Положительным результатом в РГА считают агглютинацию эритроцитов на +3 и +4. За титр диагностикума принимают его максимальное разведение, давшее гемагглютинацию не менее чем на +3.

В РТГА диагностикум используют в рабочем разведении, содержащем 8 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). Например, при титре диагностикума 1:320 — в разведении 1:40: к 2 мл диагностикума в разведении 1:10 добавляют 6 мл ББР.

Перед постановкой РТГА приготовленное рабочее разведение диагностикума кон­тролируют в РГА.

7.1.2.2.  Контроль рабочего разведения диагностикума КЭ.

В 3 ряда лунок вносят по 0,05 мл ББР, затем вносят в первую лунку каждого ряда по 0,05 мл диагностикума в рабочем разведении (например, 1:40). Раститровывают так, как описано при постановке РГА. Ставят контроль эритроцитов на спонтанную агглютина­цию: в 2-3 лунки вносят по 0,05 мл ББР. Во все лунки добавляют по 0,05 мл эритроцитов.

Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости и выдерживают при температуре от 18 до 25 °С в течение 30-40 мин. Результаты учитывают при отсутствии агглютинации в лунках контроля эритроцитов.

Рабочее разведение используют для постановки РТГА, если по результатам контроля в нем содержится 8 ГАЕ (наблюдается гемагглютинация в трех его последовательных двукратных разведениях не менее чем на +3). Если рабочее разведение диагностикума по результатам контроля не содержит 8 ГАЕ, то его необходимо приготовить заново, изме­нив соотношение препарата и разбавителя в зависимости от результата контроля. Кон­троль рабочего разведения повторяют.

7.1.3.  Проведение анализа РТГА.

В РТГА титруют исследуемые образцы (у больных одновременно титруют парные сыворотки (плазмы)), а также К+ РТГА и КРТГА.

В 4 ряда лунок планшета для иммунологических реакций, начиная со второй в каж­дом ряду (внесение ингредиентов в лунки планшета см. Таблицу 1), вносят по 0,025 мл ББР, затем в первые и вторые лунки вносят по 0,025 мл исследуемых образцов, контроль­ных образцов соответственно маркировке рядов. Перемешивают 8-10 раз при помощи пи­петки и последовательно переносят, начиная со второй, во все лунки рядов. Получают разведения исследуемых образцов, контрольных образцов с коэффициентом 2. В каждую лунку добавляют по 0,025 мл диагностикума КЭ в рабочем разведении (в нашем приме­ре- 1:40).

Одновременно ставят контроли:

—  контроль исследуемых сывороток и контрольных образцов на полноту удаления не­специфических гемагглютининов — в лунку вносят по 0,025 мл пробы и ББР;

 

—   контроль исследуемых сывороток и контрольных образцов на полноту удаления ин­гибиторов гемагглютинации — 4-5 капель пробы кипятят 1-3 мин, после чего вносят 0,025 мл в лунку и добавляют 0,025 мл диагностикума КЭ в рабочем разведении;

—   контроль рабочего разведения диагностикума КЭ — контроль проводят дважды: в день постановки опыта и в день учета его, проведение контроля описано выше;

—   контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию — в 2-3 лунки вносят по 0,05 мл ББР.

Таблица 1. Внесение ингредиентов в лунки планшета для иммунологических реакций при проведении анализа РТГА

 

Примечания: указанно количество ингредиентов в мл;

* — исследуемая сыворотка, контрольный образец, прогретые при темпе­ратуре 100 °С.

После соединения ингредиентов (компонентов смеси) планшет встряхивают в гори­зонтальной плоскости, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18-20 ч. За­тем во все лунки добавляют по 0,05 мл эритроцитов, планшет встряхивают в горизонталь­ной плоскости и выдерживают при температуре от 18 до 25 °С в течение 30-40 мин, после чего учитывают результаты.

7.2.      Реакция связывания комплемента.

Реакцию ставят микрометодом в общем объеме 0,125 мл. Для постановки реакции используют многоканальные пипетки с объемом дозирования 5-50 мкл, погрешностью измерения объемов не более 5 % и планшеты для иммунологических реакций.

Реакцию ставят в два этапа. Первый этап — определение титра комплемента в при­сутствии диагностикума и выбор его рабочего разведения, содержащего 2 единицы ком­племента. Второй этап — определение титра исследуемых сывороток и контрольных об­разцов методом линейного титрования с использованием 4 комплементсвязывающих еди­ниц (КСЕ) диагностикума.

7.2.1.          Подготовка реагентов для анализа.

7.2.1.1.   Разбавитель.

В 1 л 0,9 % раствора натрия хлорида растворяют 0,1 г магния хлорида шестиводного по ГОСТ 4209-77 и 0,04 г кальция хлорида двуводного по ТУ 6-09-5077-83, фильтруют через бумажный фильтр.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут.

7.2.1.2.   Диагностикум КЭ.

В ампулу с диагностикумом КЭ вносят 1 мл воды, через 1-2 мин готовят рабочее разведение, содержащее 4 КСЕ диагностикума, исходя из титра, указанного на ампуле (этикетке). Например, 1:8 (при титре в РСК 1:32): к 1 мл диагностикума добавляют 7 мл Разбавителя, выдерживают 1-1,5 ч при температуре от 2 до 8 °С для стабилизации.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 1 сут.

7.2.1.3.   Положительный контрольный образец для РСК. В ампулу с К+ РСК вносят 0,5 мл воды, затем готовят разведение, соответствующее 4-кратному титру, указанному на ампуле (этикетке) контрольного образца, например, 1:16 (при титре 1:64): к 0,5 мл К+ РСК добавляют 7,5 мл Разбавителя. Прогревают на аппарате для инактивации сывороток (во­дяной бане) при температуре 59-61 °С в течение 30 мин.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.

7.2.1.4.   Отрицательный контрольный образец для РСК. В ампулу с К РСК вносят 0,5 мл воды, затем добавляют 3,5 мл Разбавителя (разведение 1:8). Прогревают на аппара­те для инактивации сывороток (водяной бане) при температуре 59-61 °С в течение 30 мин.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.

7.2.1.5.   Исследуемые образцы. Подготовка образцов для анализа в РСК описана в разделе 6.

7.2.1.6.   Комплемент.

В ампулу с «Комплементом сухим» (по ТУ 8990-016-14237183-2007) вносят 0,9 % раствор натрия хлорида в объеме, указанном на ампуле (этикетке). Выдерживают для ста­билизации при температуре от 2 до 8 °С в течение 1-1,5 ч. Используют в течение 1 сут.

7.2.1.7.   Сыворотка гемолитическая.

Готовят рабочее разведение, соответствующее утроенному титру, указанному на ам­пуле (этикетке) гемолитической сыворотки по ТУ 9389-029-14237183-2007. Например,

1:400 (при титре гемолитической сыворотки 1:1200): к 10 мл Разбавителя добавляют 0,025 мл гемолитической сыворотки из ампулы.

Хранение рабочего разведения: при температуре от 2 до 8 °С не более 1 сут.

7.2.1.8.  Эритроциты барана.

Используют консервированную кровь барана (ФСП 42-0504-3843-04) или дефибринированную свежую кровь. Кровь у барана берут из яремной вены стерильной иглой во флакон со стеклянными бусами. Флакон с кровью непрерывно встряхивают вручную для дефибринирования крови. Дефибринированную кровь фильтруют через 2-3 слоя марли.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение 7-8 сут.

Для получения эритроцитов непосредственно перед использованием необходимое количество крови центрифугируют при 1800-2000 об/мин в течение 8-10 мин. Осадок эритроцитов трижды отмывают, ресуспендируя в 10-15 кратном количестве 0,9 % раство­ра натрия хлорида и осаждая центрифугированием при 1800-2000 об/мин в течение 10-15 мин.

Готовят 2 % взвесь эритроцитов: к 9,8 мл Разбавителя добавляют 0,2 мл эритроцитов из осадка. Взвесь эритроцитов хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 сут.

7.2.1.9.  Гемолитическая система (гемсистема).

Смесь равных объемов гемолитической сыворотки в рабочем разведении и

1   % взвеси эритроцитов: ингредиенты смешивают, приливая сыворотку ко взвеси эритро­цитов, и прогревают в термостате при температуре от 36 до 38 °С в течение 30 мин, встря­хивая каждые 10-15 мин. Используют сразу после приготовления. Гемсистему готовят дважды: в день титрования комплемента и в день учета основного опыта.

7.2.2.  Проведение анализа.

7.2.2.1.  Титрование комплемента.

В пробирках готовят ряд разведений комплемента (см. Таблицу 2): исходные — 1:10, 1:15, 1:25 — соединяя 0,3; 0,2 и 0,1 мл комплемента с 2,7; 2,8 и 2,4 мл Разбавителя соответ­ственно. Из исходных концентраций комплемента, соединяя их и Разбавитель в равных объемах (по 1 мл), готовят разведения 1:20, 1:30, 1:50, и из них точно так же — разведения 1:40, 1:60, 1:100 и т.д.

Таблица 2. Разведение комплемента

В соответствии с Таблицей 3 в 2 ряда лунок планшета для иммунологических реакций вносят по 0,025 мл Разбавителя, по 0,025 мл комплемента в разведениях, начиная с наиболь­шего, по 0,025 мл диагностикума КЭ в разведении 1:8. Ставят контроль гемсистемы: в 2-3 лунки вносят по 0,075 мл Разбавителя. Планшет помещают в термостат при температуре от 36 до 38 °С на 30 мин, после чего во все лунки добавляют по 0,05 мл гемсистемы, планшет встряхивают в горизонтальной плоскости, выдерживают при температуре от 36 до 38 °С в течение 30 мин, встряхивая через каждые 10-15 мин.

Таблица 3. Титрование комплемента: соединение ингредиентов и результаты

Результаты учитывают по 4-крестовой системе при условии полной задержки гемо­лиза в лунках контроля гемсистемы:

плюс 4 (+4) — полная задержка гемолиза;

плюс 3 (+3) — гемолиз незначительной массы эритроцитов (25 %); плюс 2 (+2) — гемолиз половины эритроцитов (50 %); плюс 1 (+1) — гемолиз основной массы эритроцитов (75 %); минус (-) — гемолиз всей массы эритроцитов (полный гемолиз).

За единицу комплемента (1 ед.) принимают его разведение в последней лунке с пол­ным гемолизом. В нашем примере (Таблица 3) 1 ед. комплемента соответствует разведе­нию 1:60; 2 ед. — разведению 1:30.

7.2.2.1.  Определение титров антител к вирусу КЭ в исследуемых образцах.

Линейное титрование исследуемых образцов.

Определяют титры антител к вирусу клещевого энцефалита исследуемых образцов и контрольных образцов. У больных одновременно титруют парные сыворотки (или плазмы). Соединение ингредиентов при линейном титровании проводят в соответствие с Таблицей 5. Повышающиеся двукратные разведения исследуемых и контрольных образцов готовят в

планшете: в 4 ряда лунок, начиная со вторых, вносят по 0,025 мл Разбавителя, в первую и вторую лунки каждого ряда вносят по 0,025 мл соответствующей пробы в исходном разве­дении 1:4 или 1:8. Перемешивают и переносят при помощи пипетки так, как описано выше, добавляют в каждую лунку по 0,025 мл диагностикума в рабочем разведении 1:8 и по 0,025 мл комплемента в разведении, содержащем 2 ед. (например, 1:30).

Одновременно ставят контроли:

—       контроль исследуемых образцов и контрольных образцов на антикомплементар- ность — в лунку вносят по 0,025 мл образца в исходном разведении, 0,025 мл Разбавителя, 0,025 мл комплемента;

—       контроль диагностикума на антикомплементарность — в лунку вносят по 0,025 мл диагностикума в рабочем разведении, Разбавителя, комплемента;

—       контроль диагностикума на гемотоксичность — в лунку вносят 0,025 мл диагно­стикума в рабочем разведении и 0,05 мл Разбавителя;

—       контроль гемсистемы — в 2-3 лунки вносят по 0,075 мл Разбавителя;

—       контроль 4 КСЕ диагностикума КЭ — в лунках планшета (или вспомогательных пробирках) готовят разведения диагностикума КЭ на Разбавителе (от 1:8 до 1:64), затем в лунках планшета соединяют по 0,025 мл каждого из разведений диагностикума КЭ с 0,025 мл К+ РСК в 4-кратном титре (в нашем примере в разведении 1:16) и 0,025 мл ком­племента.

Ставят контроль доз комплемента, использованных для анализа:

1)   из рабочего разведения комплемента, содержащего 2 ед., готовят разведения, со­держащие 1,5 ед.; 1 ед.; 0,5 ед. (соединение ингредиентов см. в Таблице 4);

2)   соединяют по 0,025 мл диагностикума в рабочем разведении, 0,025 мл каждого из разведений комплемента, 0,025 мл Разбавителя (см. Таблицу 5).

Таблица 4. Приготовление рабочих разведений комплемента

Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18-20 ч. После этого во все лунки вносят по 0,05 мл гемсистемы, встряхивают и выдерживают при температуре от 36 до 38 °С в течение 30-40 мин (каждые 10-15 мин встряхивают), затем учитывают результаты.

Таблица 5. Внесение ингредиентов в лунки планшета для иммунологических реакций в опыте РСК (линейное титрование сывороток и контрольных образцов)

 

7.3.      Реакция радиального гемолиза в геле.

7.3.1.         Подготовка реагентов для анализа.

7.3.1.1.   Фосфатный буферный раствор pH 7,2-7,3 (ФБР).

Для приготовления раствора используют реактивы:

—  натрия хлорид по ГОСТ 4233-77 или ФСП 42-4119-08, или ФСП 42-1619-07 — 8,0 г;

—  калия хлорид по ГОСТ 4234-77 — 0,2 г;

—  калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 2493-75 — 0,2 г;

—  натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172-76 — 2,9 г;

—  вода очищенная или вода дистиллированная — до 1 л.

pH должен быть 7,2-7,3. Определяют потенциометрически. ФБР используют для от­мывания эритроцитов и приготовления агарозного геля.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут.

7.3.1.2.   Боратный буферный раствор pH 9,00±0,05.

Для приготовления раствора используют реактивы:

—  натрия хлорид — 0,7 г;

—  кислота борная по ГОСТ 9656-75 — 0,32 г;

—  4 % раствор натрия гидроксида — 2-2,2 мл;

—  вода очищенная или вода дистиллированная — до 100 мл.

pH боратного буферного раствора доводят до 9,00+0,05 добавлением 4 % раствора натрия гидроксида. Определяют потенциометрически. Используют для приготовления ра­бочего раствора.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут.

7.3.1.3.   Рабочий раствор (РР) — смесь боратного буферного раствора pH 9,00±0,05, фосфатного буферного раствора № 1 (pH 5,8) и фосфатного буферного раствора № 2 (pH 7,0).

В состав фосфатного буферного раствора № 1 входят:

—  натрия хлорид — 0,88 г;

—  натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245-76 — 2,86 г;

—  натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный — 0,6 г;

—  вода очищенная или вода дистиллированная — до 100 мл.

В состав фосфатного буферного раствора № 2 входят:

—  натрия хлорид — 0,88 г;

—  натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный — 1,24 г;

—  натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный — 4,3 г;

—  вода очищенная или вода дистиллированная — до 100 мл.

Для приготовления растворов № 1 и № 2 реактивы в указанных количествах раство­ряют в воде. Для приготовления РР соединяют 10 частей боратного буферного раствора, 8 частей фосфатного буферного раствора № 1 и 2 части фосфатного буферного раствора № 2. pH раствора, контролируемый потенциометрически, должен быть 6,20±0,05. РР стерилизуют в автоклаве при температуре (120±1) °С и давлении пара (0,10±0,01) МПа в те­чение 30 мин.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут.

7.3.1.4.    Эритроциты барана.

Используют консервированную кровь барана (ФСП 42-0504-3843-04) или свежепри­готовленную дефибринированную кровь (см. п. 7.2.1.8). Эритроциты осаждают и трижды отмывают в 3-4-кратном объеме 0,9 % раствора натрия хлорида pH 7,2-7,4, центрифугируя при 1800-2000 об/мин в течение 10-15 мин. Готовят 10 % взвесь эритроцитов на 0,9 % растворе натрия хлорида. Взвесь хранят в широкодонных колбах толщиной слоя не более 3 см при температуре от 2 до 8 °С в течение 2-3 сут.

7.3.1.5.    Комплемент.

Для постановки РРГ пригоден «Комплемент сухой» (по ТУ 8990-016-14237183-2007) с активностью не ниже разведения 1:60 (см. постановку РСК). В ампулу вносят 0,9 % раствор натрия хлорида до объема, указанного на ампуле (этикетке). Используют в течение 1 сут.

7.3.1.6.    Диагностикум КЭ.

В ампулу с диагностикумом вносят 1 мл воды. Выдерживают 1-1,5 ч при температу­ре от 2 до 8 °С для стабилизации.

Хранение: не более 7 сут при температуре от 2 до 8 °С.

7.3.1.7.    Положительный контрольный образец для РСК.

В ампулу с К+ РСК вносят 0,5 мл воды. К+ РСК в количестве 0,1 мл прогревают 30 мин при температуре 59-61 °С.

Хранение: не более 7 сут при температуре от 2 до 8 °С.

7.3.1.8.    Отрицательный контрольный образец для РСК.

В ампулу с К~ РСК вносят 0,5 мл воды. Прогревают и хранят так же, как К+ РСК.

7.3.1.9.    Исследуемые образцы.

Нативные сыворотки (плазмы) крови человека или животных в количестве 0,1 мл прогревают в зависимости от вида так же, как для РСК (см. раздел 6). Сыворотки кроли­ков и гемолизированные сыворотки перед прогреванием разводят в ФБР в соотношении 1:4.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут.

7.3.1.10. Раствор калия метапериодата в концентрации 0,001 М.

Навеску 0,023 г калия метапериодата по ТУ 6-09-02-364-83 или аналогичного рас­творяют в 100 мл PP.

Хранение: в темной посуде при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.

7.3.1.11.  Раствор борной кислоты 1 %. Навеску борной кислоты (ГОСТ 9656-75) 1 г растворяют в 100 мл PP.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение любого времени.

7.3.1.12.  Сенсибилизация эритроцитов барана.

1,66 мл 10 % суспензии эритроцитов отмывают один раз в ФБР pH 7,2-7,3. К осадку отмытых эритроцитов добавляют 1,5 мл РР и 0,7 мл 0,001 М раствора калия метапериодата, перемешивают, выдерживают при температуре от 36 до 38 °С в течение 10 мин, затем дважды отмывают в 10-кратном объеме ФБР pH 7,2-7,3. Эритроциты осаждают центрифу­гированием при 1800-2000 об/мин в течение 10-15 мин, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1,5 мл РР. Полученную взвесь эритроцитов смешивают с 0,55 мл ди­агностикума КЭ, выдерживают при температуре от 18 до 25 °С в течение 10-15 мин, после чего эритроциты трижды отмывают в ФБР pH 7,2-7,3 так, как описано выше. К осадку эритроцитов добавляют 1,5 мл РР и 0,2-0,25 мл комплемента.

7.3.1.13.  Приготовление агарозного геля. Для приготовления агарозного геля в одной чашке Петри диаметром 100 мм необходимо 0,07 г агарозы (Агароза «Pharmacia» кат. № 17-0422-02 или «Fluka» кат. № 05075); 1,66 мл 10 % взвеси эритроцитов; 0,55 мл диагностикума КЭ; 0,20-0,25 мл комплемента; 0,1 мл 1 % раствора борной кислоты.

Подготовка агарозы.

К 0,07 г агарозы в стакане (флаконе) вместимостью 50-100 мл добавляют 13,8 мл ФБР pH 7,2-7,3 и кипятят на водяной бане 5-7 мин до полного расплавления агарозы. Рас­плавленную агарозу охлаждают до 42 °С и вносят 0,1 мл 1 % раствора борной кислоты.

Заливка чашек Петри.

Сенсибилизированные эритроциты, подготовленные так, как описано выше, выли­вают в стакан (флакон) с расплавленной и охлажденной до 42 °С агарозой, смесь немед­ленно перемешивают до однородного состояния и заливают в чашку Петри, установлен­ную горизонтально по уровню. Толщина пласта агарозного геля должна быть 2-3 мм. После застывания геля (через 3-5 мин) чашку закрывают крышкой и переворачивают на 30-40 мин для уплотнения геля. В застывшем слое агарозы металлической или стеклянной трубкой диаметром (2,00+0,05) мм вырезают 20-40 лунок на расстоянии 13-20 мм друг от друга и отсасывают гель. Для выполнения этих манипуляций может служить игла для взя­тия крови по ОСТ 54-1-102-82 диаметром 20 мм с отпиленным концом, соединенная с грушей.

7.3.2.  Проведение анализа РРГ.

В лунки вносят по 5 мкл исследуемых образцов, а также контрольные образцы: К+ РСК и К РСК. Чашку закрывают крышкой и выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18-20 ч, а затем при температуре от 36 до 38 °С в течение 1,5-2,5 ч.

Параллельно с основным опытом ставят контрольный опыт на агарозной пластинке с несенсибилизированными эритроцитами для исключения неспецифического гемолиза. Подготовку эритроцитов для контрольного опыта проводят так же, как для основного, но их не соединяют с диагностикумом КЭ.

8.  РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.

8.1.  Регистрацию результатов РТГА, РСК, РРГ проводят визуально.

9.  УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.

9.1.    УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ (РТГА).

После добавления взвеси эритроцитов и экспозиции 30-45 мин учитывают результа­ты реакции. При наличии антител к вирусу КЭ в образце происходит торможение гемагглютинации. В этом случае эритроциты оседают на дне «пуговкой». При отрицательных результатах (отсутствии антител к вирусу КЭ) агглютинированные эритроциты прилипа­ют к стенкам лунок в виде зонтика.

Реакцию учитывают, если:

—  наблюдается полное оседание эритроцитов (-) в контролях эритроцитов на спон­танную агглютинацию, контролях исследуемых сывороток и контрольных образцов на полноту удаления неспецифических гемагглютининов;

—  наблюдается гемагглютинация не менее чем на +3 в контроле рабочего разведения диагностикума в трех последовательных разведениях, а также в контролях исследуемых сывороток и контрольных образцов на полноту удаления ингибиторов гемагглютинации.

За титр исследуемого или контрольного образца принимают их максимальное разве­дение, дающее полную (-) задержку гемагглютинации с 8 ГАЕ диагностикума.

В Таблице 6 приведен пример результатов РТГА. Титр К+ РТГА — 1:320, исследуе­мой сыворотки II — 1:40, исследуемая сыворотка I и К“ РТГА не содержат антител к виру­су КЭ, реакция специфична, использовано 8 ГАЕ диагностикума.

Специфическим считают титр антител 1:20 и выше, сомнительным — 1:10. У боль­ных диагностическим считают нарастание титра антител в парных сыворотках в 4 раза и больше.

Таблица 6. Примерный протокол РТГА

9.2.  УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РСК.

Результаты РСК (опыта линейного титрования) учитывают по 4-крестовой системе, если наблюдаются следующие результаты в контрольных лунках:

—    полная задержка гемолиза в лунках контроля гемсистемы, а также контроля диаг­ностикума КЭ на гемотоксичность;

—    полный гемолиз в лунках контролей на антикомплементарность исследуемых об­разцов, контрольных образцов и диагностикума КЭ;

—    в контроле доз комплемента (см. Таблицу 7) результаты соответствуют вариантам III или IV (т.е. рабочее разведение, использованное в реакции, содержит 1,5 ед. компле­мента).

Таблица 7. Пример учета результатов РСК в зависимости от результатов контроля доз комплемента

За титр исследуемого или контрольного образца при использовании 4 КСЕ диагно­стикума принимают его максимальное разведение, давшее интенсивную задержку гемоли­за не менее чем на +3.

Реакцию считают специфичной, если диагностикум КЭ не выявляет антитела в К РСК, а в опыте с К+ РСК и в контроле 4 КСЕ диагностикума выявлены титры этих пре­паратов, соответственно указанные на ампулах (этикетках), или отличающиеся от них не более чем на одно разведение.

В примере (Таблица 8) результаты опыта учитывают, так как по результатам контро­ля доз комплемента в реакции использовано 1,5 ед. комплемента, титр исследуемого об­разца 1-0, титр исследуемого образца II — 1:16, подтверждены титры К+ РСК — 1:64 и ди­агностикума — 1:32, в К РСК антитела не выявлены. Реакция специфична.

Диагностическим считают нарастание титра антител в парных сыворотках в 4 раза и больше.

Исследуемые образцы, в которых по результатам контроля обнаружена антикомплементарность, обрабатывают одним из способов:

а) прогревают при температуре на 1 -2 °С выше необходимой для данного вида сыво­ротки (см. раздел 6);

б) замораживают при температуре минус (15-20) °С, оттаивают, осадок удаляют центрифугированием при 2000-2500 об/мин в течение 25-30 мин.

Затем РСК повторяют с обработанным образцом. При неудовлетворительных результатах повторного контроля данный образец не пригоден для испытания в РСК.

Таблица 8. Результаты титрования сывороток и контрольных образцов (примерный протокол РСК)

9.3.  УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РРГ.

Результаты учитывают визуально, просматривая чашки Петри в проходящем свете при снятой крышке. Положительный результат, свидетельствующий о наличии специфи­ческих антител в исследуемых образцах и положительном контрольном образце — про­зрачная зона гемолиза диаметром не менее 4 мм вокруг лунки, в центре которой иногда остаются нелизированные эритроциты. Отрицательный результат — полное отсутствие зо­ны гемолиза вокруг лунки с сывороткой.

Реакцию считают специфичной, если в основном опыте К+ РСК дает положительный результат, К РСК — отрицательный. При этом в контрольном опыте с несенсибилизированными эритроцитами гемолиза быть не должно. Причиной неспецифического гемолиза может быть нестерильность сывороток, для исследования таких сывороток рекомендуется добавлять в них 1 % раствор борной кислоты в количестве 1-2 капли на 2-4 мл сыворотки.

10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА

Набор реагентов необходимо хранить при температуре от 2 до 8 °С.

Срок годности 3 года со дня изготовления. Набор реагентов с истекшим сроком год­ности использованию не подлежит.

Транспортирование набора производится при температуре от 2 до 8 °С. Допускается кратковременное (до 48 ч) транспортирование при температуре от 9 до 25 °С.

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей инструкции по применению.

Диагностикум клещевого энцефалита



Обратите Внимание

Это покупают чаще всего