Диагностикум клещевого энцефалита

1.   НАЗНАЧЕНИЕ

Набор реагентов предназначен для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита (КЭ) в образцах сывороток или плазм крови людей и животных в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции радиального гемолиза в геле (РРГ).

Область применения:

1.     Клиническая микробиология. Для подтверждения клинического диагноза у больных с подозрением на клещевой энцефалит исследуют парные сыворотки, полученные на 5-7 и 14-21 дни заболевания.

2.     Эпидемиологические исследования. Набор может быть использован для изучения иммунного статуса людей и животных в эндемичных районах. Для этих целей рекомендуется комплексная диагностика в РТГА и РРГ.

3.     Производство иммунобиологических препаратов. Набор используют для оценки специфической активности препаратов иммуноглобулинов против КЭ, для изучения клинической эффективности вакцины клещевого энцефалита в РТГА. Набор и отдельные реагенты могут быть использованы для производства и контроля других диагностических препа­ратов клещевого энцефалита (иммуноферментных тест-систем).

2.  ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1.  Принцип метода.

Специфическим компонентом набора является диагностикум КЭ, который способен выявлять антитела к вирусу клещевого энцефалита в сыворотках крови (плазме, асцитной жидкости) людей и животных в РТГА, в РСК, в РРГ.

Принцип РТГА: диагностикум КЭ (антиген вируса клещевого энцефалита) способен вызывать агглютинацию взвеси гусиных эритроцитов в зоне слабокислых значений pH. В присутствии сыворотки, содержащей антитела к вирусу клещевого энцефалита, агглю­тинация тормозится (подавляется), благодаря блокировке ответственного за этот феномен антигена — гемагглютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона.

Принцип РСК: комплекс антиген-антитело обладает способностью связывать комплемент. В реакции участвуют две системы антиген+антитело: специфическая — (диагностикум КЭ + сыворотка крови людей или животных) и индикаторная — (эритроциты барана + гемолизин). При взаимодействии вирусных антигенов с антителами (на первом этапе реакции) с комплексом антиген-антитело связывается комплемент, и он уже не может быть использован для лизиса эритроцитов (которые в смеси с гемолизином добавляют на втором этапе реакции). Таким образом, отсутствие лизиса эритроцитов говорит о положительном результате реакции (наличии антител к вирусу клещевого энцефалита в исследуемом образце).

Принцип РРГ: при взаимодействии с антителами сенсибилизированных вирусным антигеном эритроцитов барана в присутствии комплемента происходит реакция лизиса эритроцитов. Суспензию бараньих эритроцитов обрабатывают диагностикумом КЭ, отмывают и вносят в расплавленный агарозный гель, одновременно добавляя туда комплемент. После перемешивания гель тонким слоем наливают на стеклянную пластину и после затвердения вырезают в нем лунки диаметром 2 мм. В лунки наливают по 5 мкл исследуемой сыворотки (предварительно прогретой для удаления содержащегося в них комплемента). Диффундируя через гель, антитела образуют комплекс с антигеном и комплементом на поверхности эритроцитов, следствием чего является лизис. Вокруг лунок образуется прозрачная зона гемолиза, диаметр которой прямо пропорционален концен­трации специфических антител.

2.2.  Состав набора.

1.   Диагностикум клещевого энцефалита (диагностикум КЭ) — антиген вируса клеще­вого энцефалита, полученный из мозга белых мышей, инфицированных вирусом КЭ, ме­тодом боратно-солевой экстракции, очищенный протаминсульфатом или фреоном-113, инактивированный бетапропиолактоном, лиофилизованный — аморфный порошок кремо­вого цвета, после растворения — прозрачная жидкость светло-желтого цвета, выпускаемый в комплекте с реагентами для постановки РТГА, РСК и РРГ. Титр специфических гемагглютининов не ниже чем 1:160, комплементсвязывающих антигенов — на ниже чем 1:32 — 10 ампул по 1 мл.

2.   Положительный контрольный образец для РТГА (К⁺ РТГА) — асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ (в виде 10 % вируссодержащей суспензии мозга крысят-сосунков) с последующим введением в брюшную полость крыс клеток опу­холи яичника крысы для индукции асцита, обработанная хлороформом, каолином и гуси­ными эритроцитами, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрачная жидкость от светло-желтого до светло-рубинового цвета. Титр антигемагглютинирующих антител — не ниже чем 1:160 — 2 ампулы по 1 мл.

3.   Отрицательный контрольный образец для РТГА (К^— РТГА) — асцитная жидкость неиммунизированных крыс, индуцированная путем введения клеток опухоли яичника крысы, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрач­ная жидкость от светло-желтого до светло-рубинового цвета — 2 ампулы по 1 мл.

4.    Положительный контрольный образец для РСК (К⁺ РСК) — асцитная жидкость крыс, иммунизированных живым вирусом КЭ, обработанная хлороформом, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрач­ная жидкость от желтого до рубинового цвета. Титр комплементсвязывающих антител не ниже чем 1:32-2 ампулы по 0,5 мл.

5.    Отрицательный контрольный образец для РСК (К^— РСК) — асцитная жидкость неиммунизированных крыс, обработанная хлороформом, лиофилизированная — пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения — прозрачная жидкость от желтого до рубинового цвета — 2 ампулы по 0,5 мл.

6.        Смесь солей для приготовления боратного буферного раствора (ББР) pH 9,00±0,05 — таблетка белого цвета массой 1,05+0,02 г, в состав которой входят: натрия хлорид — 0,7 г; кислота борная — 0,32 г; кальция стеарат или магния стеарат (наполнитель)

—    0,03 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора ББР. По 1 таблетке в пакете из ПЭ пленки — 3 пакета.

7.        Смесь солей для приготовления фосфатного буферного раствора (ФБР) pH 6,20+0,05 — таблетки белого цвета общей массой 4,12+0,08 г, в состав которых входят: натрия хлорид — 0,88 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный — 1,06 г; на­трий фосфорнокислый однозамещенный двуводный — 2,06 г; кальция стеарат или магния стеарат — 0,12 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора ФБР. По 4 таблетки в пакете из ПЭ пленки — 2 пакета.

8.    Смесь солей для приготовления раствора Альсевера или Гепарин, раствор для внутривенного и подкожного введения 5000 МЕ/мл (ФСП 42-0504-7813-06) — 1 ампула (1 мл).

Смесь солей для приготовления раствора Альсевера — таблетки белого цвета общей массой 5,30+0,10 г, в состав которых входят: кислота лимонная моногидрат — 0,8 г; на­трий лимоннокислый трехзамещенный моногидрат — 2,26 г; глюкоза — 2,2 г; кальция стеа­рат или магния стеарат — 0,04 г. 1 таблетка рассчитана для получения 100 мл раствора. По 5 (6) таблеток в пакете из ПЭ пленки — 1 пакет.

9.    Каолин (белая глина) по ГФ X, ст. 109 — 2 стакана по 30 г или 1 стакан по 60 г.

В коробку с набором вкладывают инструкцию по применению и нож или ска­рификатор ампульный. При упаковке ампул, имеющих кольцо излома или точку для вскрытия, нож ампульный или скарификатор ампульный не вкладывают.

Набор реагентов рассчитан на исследование 200 сывороток одновременно в трех тестах: РТГА, РСК, РРГ. Смеси солей для приготовления растворов и каолин, предназна­ченные для постановки РТГА, приложены в количестве, рассчитанном для исследования 200 или 350 сывороток при их предварительной обработке в объеме 100 мкл или 50 мкл соответственно.

3.   АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

РТГА является высокочувствительным анализом. Для флавивирусов (к которым от­носится вирус КЭ) РТГА дает группоспецифический ответ (т.е. может выявлять антитела как к видоспецифичным, так и группоспецифичным антигенным детерминантам флавиви­русов). В частности, могут наблюдаться перекрестные реакции с сыворотками, содержа­щими антитела против вирусов комплекса КЭ и комплекса японского энцефалита, но на уровне значительно ниже, чем с гомологичным антигеном.

РСК относится к числу малочувствительных методов (выявляет антитела, когда их много), при этом наряду с видоспецифичными могут обнаруживаться (в меньшей степе­ни) и группоспецифичные антитела флавивирусов. При анализе в РСК могут наблюдаться также перекрестные реакции с сыворотками, содержащими антитела к антигенам мозго­вой ткани мышей. Обнаружение специфических комплементсвязывающих антител свиде­тельствует о недавно перенесенной инфекции.

РРГ обладает чувствительностью на уровне не ниже, чем в РТГА. В данной реакции IgG-антитела выявляются даже спустя годы после заболевания.

При анализе исследуемых образцов положительным результатом в РТГА следует считать титр не ниже 1:20, в РСК — не ниже 1:4, в РРГ — зону гемолиза не менее 4 мм.

4.  МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Набор безопасен (не содержит материалов, которые могут инфицировать персонал во время анализа). Однако исследуемые сыворотки крови могут содержать различные инфек­ционные агенты. При работе с ними следует соблюдать СП 1.3.1285-03 «Безопасность рабо­ты с микроорганизмами I-II групп патогенности»:

—   работать в резиновых перчатках;

—   использовать автоматические пипетки (дозаторы) с одноразовыми пластиковыми наконечниками;

—        все использованные материалы, сточные растворы, одноразовую лабораторную посуду перед утилизацией подвергать обработке дезинфицирующим раствором (6 % рас­твор перекиси водорода или 3 % раствор хлорамина в течение 4 ч) или автоклавированием при давлении пара 0,2 МПа и температуре 132 °С в течение 45 мин;

—   оборудование, находившееся в контакте с исследуемыми образцами, следует де­зинфицировать 70 % этиловым спиртом.

При работе необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при ра­боте в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения (Москва, 1981 г.).

5.  ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

—   рН-метр;

—   весы торсионные (для постановки РРГ);

—   часы;

—   дозаторы (пипетки) переменного объема (механические или электронные): 8- или 12-канальные с объемом дозирования от 5 до 50 мкл и 1- канальные с объемом до­зирования от 10 (20) до 100 (200) мкл, от 100 до 1000 мкл и от 1 до 5 (10) мкл (для поста­новки РРГ);

—   наконечники для дозаторов на 300 (350) мкл, 1000 мкл и 10 мкл (для постановки РРГ);

—   пипетки стеклянные градуированные 2-го класса точности вместимостью 10; 5; 2; 1 мл (ГОСТ 1770-74);

—   холодильник бытовой;

—   аквадистиллятор;

—   водяная баня (аппарат для инактивации сывороток);

—   термостат;

—   центрифуга лабораторная;

—   штативы для пробирок;

—   планшеты для иммунологических реакций по ТУ 64-2-278-79;

—   чашки Петри диаметром 100 мм (для постановки РРГ);

—   стаканы химические мерные или колбы мерные вместимостью 100 мл, 1000 мл (ГОСТ 1770-74 или ГОСТ 25336-82);

—   пробирки стеклянные вместимостью 10 мл (ГОСТ 25336-82) или флаконы ФО-Ю или Ф0-20 (ТУ 9461-025-00480678-99 или ТУ 9461-010-00480514-99);

—   груша резиновая;

—   шприц (ТУ 64-1-378-90) вместимость по 10 или 20 мл;

—   бумага фильтровальная (ГОСТ 12026-76);

—   вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72) или очищенная (ФС 42-2619-97);

—   0,9 % раствор натрия хлорида по ГОСТ 4233-77 или ФСП 42-4119-08, или ФСП 42-1619-07 pH 7,2-7,4 стерильный.

Другие реактивы и материалы, необходимые для постановки анализов, описаны в разделе 7 в соответствующих подразделах «Подготовка реагентов для анализа».

6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Для анализа пригодны пробы сывороток или плазмы крови (с добавлением цитрата, гепарина, ЭДТА) человека и животных, полученные стандартными лабораторными мето­дами. В специальных случаях для анализа можно использовать асцитные жидкости жи­вотных, освобожденные от опухолевых клеток.

Пробы, подлежащие анализу, должны быть свежими и свободными от микробной контаминации во избежание ошибочных результатов. Пробы можно хранить при темпера­туре от 2 до 8 °С не более 2 недель или при температуре не выше минус 20 °С не более 1 года аликвотами (их повторное замораживание и размораживание не рекомендуется).

Образцы, содержащие осадок, следует очистить центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин.

Для РТГА исследуемые образцы перед анализом на антитела к вирусу КЭ обрабаты­вают каолином, чтобы удалить неспецифические ингибиторы гемагглютинации (ГА), а затем освобождают от нормальных гетероагглютининов, адсорбируя их эритроцитами гуся.

Для РСК исследуемые образцы сывороток (плазм) перед анализом прогревают для инактивации содержащегося в них комплемента. Образцы разводят Разбавителем (приго­товление см. п. 7.2.1.1) 1:4 или 1:8 и прогревают в зависимости от вида: сыворотки (плаз­мы) крови людей и лошадей — при температуре 57-59 °С, сыворотки крови морских сви­нок, крупного рогатого скота — при температуре 55-57 °С, сыворотки крови крыс, мышей, хомяков — при температуре 59-61 °С в течение 30 мин; сыворотки крови кроликов при температуре 64-66 °С в течение 20 мин.

7.    ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1. Реакция торможения гемагглютинации.

Реакцию ставят микрометодом в общем объеме 0,1 мл. Для постановки реакции используют многоканальные пипетки с объемом дозирования 5-50 мкл и погрешностью измерения объемов не более 5 % и планшеты для иммунологических реакций по ТУ 64-2-278-79.

Реакцию ставят в два этапа. Первый этап опыта — постановка реакции гемагглюти­нации (РГА) для определения титра диагностикума и его рабочего разведения; второй этап — постановка РТГА для определения титра исследуемых сывороток и контрольных образцов.

7.1.1.  Подготовка реагентов для анализа.

7.1.1.1.  Боратный буферный раствор pH 9,00± 0,05 (ББР).

Содержимое пакета со смесью солей (1 таблетка) растворяют в 100 мл воды при температуре 18-25 °С в течение 18-20 ч с последующим перемешиванием. При необходи­мости, для ускорения растворения подогревают на водяной бане при температуре 80-90 °С, перемешивают, охлаждают до температуры 18-25 °С. Нерастворимый осадок (наполни­тель) отделяют фильтрованием через бумажный фильтр после чего pH раствора доводят до 9,00±0,05 добавлением 2-2,2 мл 4 % раствора натрия гидроксида* по ГОСТ 4328-77, pH определяют потенциометрически.

Хранение: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.

* Примечание: 4 % раствор натрия гидроксида хранят при температуре 20-25 °С в пластиковом флаконе не более 14 сут, в стеклянном флаконе — не более 7 сут.

7.1.1.2.  Фосфатный буферный раствор pH 6,20±0,05 (ФБР).

Содержимое пакета со смесью солей (4 таблетки) растворяют в 100 мл воды при температуре 18-25 °С в течение 18-20 ч с последующим перемешиванием. При необходи­мости, для ускорения растворения подогревают на водяной бане при температуре 80-90 °С, перемешивают, охлаждают до температуры 18-25 °С. Нерастворимый осадок (наполнитель) отделяют фильтрованием через бумажный фильтр, pH определяют потенциометрически.

Хранение: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.

7.1.1.3.   Раствор Альсевера.

Содержимое пакета (5 или 6 таблеток) растворяют в 100 мл воды при температуре 18-25 °С в течение 18-20 ч с последующим перемешиванием. При необходимости для ус­корения растворения подогревают на водяной бане при температуре 80-90 °С, перемеши­вают, охлаждают до температуры 18-25 °С. Нерастворимый осадок (наполнитель) отде­ляют фильтрованием через бумажный фильтр.

Хранение: не более 2 недель при температуре от 2 до 8 °С.

7.1.1.4.   Раствор гепарина (применяют вместо раствора Альсевера) с активностью 2,5-3 ME в 1 мл. Для приготовления рабочего раствора гепарин с активностью 5000 ME в

1 мл смешивают с 0,9 % раствором натрия хлорида в соотношении 1:2000 или 1:1500.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 2 недель.

Остатки гепарина 5000 МЕ/мл переносят из ампулы в стерильный флакон.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение срока годности.

7.1.1.5.   Взвесь каолина 25 %.

30 г каолина соединяют со 120 мл ББР при постоянном помешивании. Используют не ранее, чем через 1 сут после приготовления, перед использованием тщательно взбалты­вают.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение любого времени.

7.1.1.6.   Взвесь эритроцитов гусей в ФБР 0,4 %.

Кровь у белых гусей берут из подкрыльцевой вены шприцем. Для предотвращения свертывания и консервации кровь смешивают с равным объемом раствора Альсевера или рабочего раствора гепарина.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С в течение 7-8 сут.

Для получения эритроцитов непосредственно перед использованием необходимое количество крови центрифугируют при 1500-1800 об/мин в течение 8-10 мин. Осадок эритроцитов трижды отмывают, ресуспендируя в 10-15 кратном количестве 0,9 % раство­ра натрия хлорида и осаждая центрифугированием при 1500-1800 об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость сливают.

К 25 мл ФБР добавляют 0,1 мл эритроцитов из осадка. Взвесь эритроцитов хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 сут.

7.1.1.7.   Диагностикум КЭ.

Содержимое ампулы с диагностикумом КЭ растворяют в 1 мл воды, через 1-2 мин добавляют 9 мл ББР, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 1-1,5 ч для стабилизации (разведение 1:10).

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 1 сут.

7.1.1.8.   Положительный контрольный образец для РТГА (К⁺ РТГА).

В ампулу с К⁺ РТГА вносят 1 мл воды, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 1-1,5 ч для стабилизации.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.

7.1.1.9.   Отрицательный контрольный образец для РТГА (К^— РТГА).

В ампулу с К^— РТГА вносят 1 мл воды, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 1-1,5 ч для стабилизации.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.

7.1.1.10.     Исследуемые сыворотки.

Исследуемые сыворотки обрабатывают каолином и гусиными эритроцитами для удаления неспецифических гемагглютининов и ингибиторов гемагглютинации. К 0,1 мл сыворотки добавляют 0,4 мл ББР и 0,5 мл 25 % взвеси каолина, смесь встряхивают в тече­ние 20-25 мин при температуре 20-25 °С вручную или на аппарате для встряхивания, на­пример, АВУ-6-С, центрифугируют при 2000-2500 об/мин в течение 30-35 мин.

К надосадочной жидкости добавляют 0,025 мл неразведенных эритроцитов (из осад­ка), предварительно отмытых 0,9 % раствором натрия хлорида так, как описано в п.7.1.1.6. Пробирку со смесью помещают на лед для предотвращения гемолиза, встряхивают в те­чение 20-30 мин, затем центрифугируют при 1800-2000 об/мин в течение 15-20 мин. В ре­зультате обработки получают 0,6-0,8 мл сыворотки в разведении 1:10.

Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут, для длительного хранения замораживают.

7.1.2.    Проведение реакции гемагглютинации (РГА).

7.1.2.1.   Определение титра и рабочего разведения диагностикума КЭ.

В 3 ряда лунок планшета для иммунологических реакций вносят по 0,05 мл ББР. В первую лунку каждого ряда вносят по 0,05 мл диагностикума КЭ. Перемешивают 8-10 раз при помощи многоканальной пипетки и последовательно переносят во все лунки рядов по 0,05 мл, из последней лунки убирают 0,05 мл. Получают последовательные разведения диагностикума КЭ с коэффициентом 2. Ставят контроль эритроцитов на спонтанную аг­глютинацию: по 0,05 мл ББР вносят в 2-3 лунки. Во все лунки добавляют по 0,05 мл эрит­роцитов. Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости, выдерживают при темпера­туре от 18 до 25 °С в течение 30-40 мин.

Учет реакции проводят при отсутствии агглютинации в лунках контроля эритроци­тов. Результаты учитывают визуально по 4-крестовой системе:

плюс 4 (+4) — полная гемагглютинация (однородная пленка эритроцитов, покры­вающая дно лунки);

плюс 3 (+3) — гемагглютинация меньшей степени интенсивности (однородная пленка эритроцитов со следами плотного осадка эритроцитов);

плюс 2 (+2) — частичная гемагглютинация (однородная пленка эритроцитов на дне лунки в сочетании с более плотным осадком эритроцитов);

плюс 1 (+1) — следы гемагглютинации (следы однородной пленки эритроцитов на дне лунки в сочетании с плотным осадком эритроцитов);

минус (-) — отсутствие гемагглютинации (осевшие эритроциты имеют вид компакт­ного осадка).

Положительным результатом в РГА считают агглютинацию эритроцитов на +3 и +4. За титр диагностикума принимают его максимальное разведение, давшее гемагглютинацию не менее чем на +3.

В РТГА диагностикум используют в рабочем разведении, содержащем 8 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). Например, при титре диагностикума 1:320 — в разведении 1:40: к 2 мл диагностикума в разведении 1:10 добавляют 6 мл ББР.

Перед постановкой РТГА приготовленное рабочее разведение диагностикума кон­тролируют в РГА.

7.1.2.2.  Контроль рабочего разведения диагностикума КЭ.

В 3 ряда лунок вносят по 0,05 мл ББР, затем вносят в первую лунку каждого ряда по 0,05 мл диагностикума в рабочем разведении (например, 1:40). Раститровывают так, как описано при постановке РГА. Ставят контроль эритроцитов на спонтанную агглютина­цию: в 2-3 лунки вносят по 0,05 мл ББР. Во все лунки добавляют по 0,05 мл эритроцитов.

Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости и выдерживают при температуре от 18 до 25 °С в течение 30-40 мин. Результаты учитывают при отсутствии агглютинации в лунках контроля эритроцитов.

Рабочее разведение используют для постановки РТГА, если по результатам контроля в нем содержится 8 ГАЕ (наблюдается гемагглютинация в трех его последовательных двукратных разведениях не менее чем на +3). Если рабочее разведение диагностикума по результатам контроля не содержит 8 ГАЕ, то его необходимо приготовить заново, изме­нив соотношение препарата и разбавителя в зависимости от результата контроля. Кон­троль рабочего разведения повторяют.

7.1.3.  Проведение анализа РТГА.

В РТГА титруют исследуемые образцы (у больных одновременно титруют парные сыворотки (плазмы)), а также К⁺ РТГА и К^—РТГА.

В 4 ряда лунок планшета для иммунологических реакций, начиная со второй в каж­дом ряду (внесение ингредиентов в лунки планшета см. Таблицу 1), вносят по 0,025 мл ББР, затем в первые и вторые лунки вносят по 0,025 мл исследуемых образцов, контроль­ных образцов соответственно маркировке рядов. Перемешивают 8-10 раз при помощи пи­петки и последовательно переносят, начиная со второй, во все лунки рядов. Получают разведения исследуемых образцов, контрольных образцов с коэффициентом 2. В каждую лунку добавляют по 0,025 мл диагностикума КЭ в рабочем разведении (в нашем приме­ре- 1:40).

Одновременно ставят контроли:

—  контроль исследуемых сывороток и контрольных образцов на полноту удаления не­специфических гемагглютининов — в лунку вносят по 0,025 мл пробы и ББР;